Il valore delle resistenze genotipiche di HIV nel 2023 | Alla...

Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nel trattamento contro l’infezione dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV), almeno in parte grazie alla disponibilità di farmaci antiretrovirali potenti. L'obiettivo della terapia antiretrovirale (ART) è inibire la replicazione virale nel modo più completo possibile. Tuttavia, una battuta d'arresto importante nel raggiungimento e nel mantenimento della soppressione virale è la comparsa della resistenza ai farmaci antiretrovirali, dovuta principalmente a diversi fattori, tra cui un non ottimale trattamento e aderenza, con possibilità di conseguente trasmissione di ceppi resistenti. Per questo motivo ReAdfiles ha voluto ospitare il punto di vista di un clinico e di una virologa sul ruolo e l’importanza fondamentale mantenuta nella pratica clinica dal test di resistenza genotipico.

Il punto di vista clinico

Negli ultimi anni, si è acceso un intenso dibattito riguardo la necessità del test di resistenza genotipico (GRT) nelle persone con una nuova infezione da HIV. Il GRT è una componente fondamentale nella gestione di HIV, in quanto consente ai medici di scegliere il regime di trattamento più efficace per ciascun soggetto. Tuttavia, con l'avvento di nuovi farmaci antiretrovirali ad alta barriera genetica, alcuni professionisti sanitari ed esperti di politica sanitaria hanno messo in dubbio la necessità universale di questo test.

Una delle tesi a favore di questa argomentazione sostiene che, data la bassa prevalenza di resistenze trasmesse e l’efficacia dei nuovi farmaci, l’esecuzione dei test di resistenza potrebbe non essere cost-effective, in quanto il beneficio non giustificherebbe i costi elevati associati all'esecuzione e all'interpretazione del test, soprattutto in contesti a risorse limitate (1).

Anche le linee guida sono eterogenee su questo argomento. Ad esempio, le DHHS americane raccomandano l’esecuzione del GRT nei naive solamente per quanto riguarda la proteasi e la retro-trascrittasi (PR/RT), riservando la ricerca di mutazioni per integrasi (INT) solo nel sospetto di resistenze trasmesse per INT o se presente storia di profilassi pre-esposizione con cabotegravir (CAB) long-acting (2). Al contrario, le linee guida EACS non pongono limitazioni all’esecuzione dei test di resistenza. Queste riflettono i diversi approcci alla gestione delle risorse sanitarie (3). Alcuni esperti sostengono che un approccio più selettivo al test di resistenza potrebbe consentire di risparmiare risorse preziose, mentre altri sottolineano l'importanza di un'identificazione precoce delle resistenze per ottimizzare l'esito del trattamento, dal momento che il successo della terapia va preservato a lungo termine.

In Italia, al recente congresso ICAR (Italian Conference on AIDS and Antiviral Research) 2023, è stato organizzato un simposio su questo tema, intitolato “Controversie nella virologia clinica dell'HIV - Dobbiamo ancora preoccuparci della resistenza ai farmaci? Il punto di vista del clinico e del virologo”.

Tra gli aspetti principali sono emersi i concetti di resistenze trasmesse e acquisite, ad esempio nello studio di Miranda et al., che ha evidenziato che negli ultimi anni il numero di resistenze trasmesse e resistenze acquisite è in calo (4). Tuttavia, è importante notare come per alcuni trattamenti sia necessaria l’assenza di mutazioni nel GRT, come ad esempio per il trattamento di prima linea con lamivudina e dolutegravir nei soggetti naive, oppure per la terapia con rilpivirina (RPV) e CAB long-acting nello switch terapeutico.

Durante ICAR 2023 sono stati mostrati i risultati di una survey eseguita dal gruppo di ricerca ARCA, in cui si è valutato l’utilizzo del GRT in 97 centri di Malattie Infettive in Italia (Figura 1) (5).

Sette di questi hanno dichiarato di non richiedere il test di resistenza. Dei 90 che invece lo richiedevano, tutti quanti hanno risposto che lo richiedono in caso di fallimento virologico, mentre 86 (95%) lo richiedono anche nelle persone naive prima di iniziare il trattamento per impostare la scelta del regime. In particolare, 83 di questi ultimi hanno risposto che richiedono non solo il test di resistenza per PR/RT, ma anche per INT.

Interessante notare come nei vari centri c’è una buona eterogeneità nei tempi di risposta del GRT, dove il 25% riesce ad ottenerlo entro 2 settimane, un altro 25% deve aspettare più di un mese e il restante 50% riesce ad avere un GRT in 2-4 settimane.

Alla domanda finale “Ritenete che il test di resistenza nei naive sia ancora cruciale”, 82 centri su 90 hanno risposto di si, mostrando come, almeno in Italia, il GRT nelle nuove infezioni da HIV rimanga un esame fondamentale per l’approccio terapeutico.

Il punto di vista virologico

Nonostante il decremento della prevalenza delle mutazioni trasmesse, come emerso a ICAR 2023, ad oggi tale prevalenza in Italia risulta essere dell’8% ed è soprattutto a carico dell’RT (6). Questo dato sottolinea l’esigenza di una caratterizzazione virologica accurata e costante partendo già dalla diagnosi dell’infezione da HIV, anche alla luce del fatto che tale infezione richiede un trattamento per tutta la vita. Questa “fotografia” del virus alla diagnosi rappresenta la base per valutare l’evoluzione virale nel tempo e, in associazione al profilo di resistenza del reservoir virale, è essenziale in contesti di fallimento virologico e può essere utile anche in caso di ottimizzazione della terapia. I GRT attraverso il sequenziamento Sanger di HIV-RNA plasmatico supportano da tempo la ART; tuttavia, forniscono solo una piccola parte delle informazioni sulla resistenza in quanto incapaci di rilevare le varianti con frequenze intra-ospite <20% (7-9).

L'introduzione di approcci di next generation sequencing (NGS) caratterizzati da maggiore sensibilità hanno consentito di rilevare varianti virali a bassa frequenza (<20%) (10). Oggi molti laboratori stanno passando all’NGS per la valutazione della farmacoresistenza. Questa transizione è stata evidenziata anche in Italia, grazie al gruppo di ricerca ARCA, con una survey virologica nazionale composta da 19 domande sull'utilizzo e l'interpretazione del GRT. Infatti, 25/35 centri partecipanti utilizzano piattaforme NGS; la maggior parte di questi (88%) utilizza la piattaforma Illumina con un test commerciale (Figura 2) (11).

Nonostante lo sviluppo di kit commerciali, i protocolli devono essere ancora perfezionati e diversi punti di domanda devono avere risposta. Tra questi, stabilire il sistema di analisi più adatto e soprattutto definire i cutoff tecnico e clinico utili per la rilevazione delle varianti minoritarie. Dalla survey è emerso l’uso di diversi software per l’analisi di PR/RT e INT, ma SmartVir (N=18) e Stanford (N=21) risultano essere i più utilizzati.

Analogo discorso per il tropismo, 11 centri effettuano un’analisi combinata (SmartVir+Geno2pheno) mentre i restanti utilizzano un unico sistema (Geno2pheno o SmartVir).

Uno dei punti cruciali nell’utilizzo dell’NGS è l’interpretazione di risultati soprattutto delle mutazioni rilevate <20%. Nei casi in cui tali mutazioni vengano riportate nel referto, non è sempre facile per il clinico interpretarle. La metà dei centri della survey riporta nel referto anche la percentuale di varianti (N=15), 8 centri ne indicano solo la presenza mentre un centro utilizza un limite del 20% (assimilabile al Sanger).

Studi precedenti hanno suggerito che una soglia del 5% potrebbe fornire una correlazione clinicamente rilevante riproducibile con l'esito del trattamento (12). Questo è in linea con un lavoro sui soggetti heavily treatment-experienced presentato da D. Armenia a ICAR 2023, che ha mostrato un numero elevato di ipermutazioni correlate ad APOBEC e sostituzioni insolite nelle posizioni di resistenza in GRT su HIV DNA, utilizzando il cutoff dell’1%, sottolineando la scarsa affidabilità di tale cutoff in quanto le varianti osservate <5% potrebbero essere frutto di artefatti di sequenza (13).

A tutto questo va aggiunto il significato clinico del reservoir virale e quindi del GRT su DNA. Il GRT su plasma identifica preferenzialmente le mutazioni di resistenza del virus circolante e resistente all'attuale regime terapeutico, mentre il GRT su DNA riassume la storia archiviata delle pressioni selettive esercitate dai regimi terapeutici e/o dalla resistenza trasmessa, e identifica mutazioni di varianti virali che si sono replicate nell'ospite durante le fasi viremiche. Quindi, tali mutazioni riflettono le mutazioni emerse da precedenti fallimenti terapeutici o mutazioni trasmesse (14).

Il reale valore di queste mutazioni sull’outcome virologico è tuttavia ancora controverso. Nonostante ciò, nel regime CAB LA + RPV è stato dimostrato che le mutazioni provirali di RPV al basale erano associate a fallimento virologico (15).

Il ruolo cruciale del GRT è stato osservato anche durante low-level viraemia (LLV), evidenziando una forte associazione tra le mutazioni rilevate durante LLV e il successivo fallimento virologico (16).

Nonostante le domande non ancora del tutto risolte sull’utilizzo dell’NGS nella farmacoresistenza, il GRT rimane ancora cruciale per una corretta gestione a lungo termine dell’infezione da HIV, ed auspicabilmente dovrà essere implementato in tutti i centri clinici nazionali.

1. Hyle EP, Scott JA, Sax PE, et al. Clinical Impact and Cost-effectiveness of Genotype Testing at Human Immunodeficiency Virus Diagnosis in the United States. Clinical Infectious Diseases. 2020;70(7):1353–63.
2. Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV. Department of Health and Human Services. https://clinicalinfo.hiv.gov/en/guidelines/adult-and-adolescent-arv
3. EACS Guidelines Version 11.1 - October 2022. https://www.eacsociety.org/media/guidelines-11.1_final_09-10.pdf
4. Miranda MNS, Pingarilho M, Pimentel V, et al. Trends of Transmitted and Acquired Drug Resistance in Europe From 1981 to 2019: A Comparison Between the Populations of Late Presenters and Non-late Presenters. Front Microbiol. 2022;13:846943.
5. De Vito A, Bezenchek A, Scutari R, et al. Use of HIV Genotype Resistance test in Italy: A National Survey. ICAR 2023, Poster 320.
6. Fabeni L, Armenia D, Abbate I, et al. The Italian Resistance group. HIV-1 Transmitted Drug Resistance in Newly Diagnosed Individuals in Italy Over the Period 2015-2021. ICAR 2023, Oral communication 5.
7. Lee ER, Parkin N, Jennings C, et al. Performance comparison of next generation sequencing analysis pipelines for HIV-1 drug resistance testing. Sci Rep. 2020; 10(1):1634.
8. Schuurman R, Brambilla D, De Groot T, et al. Underestimation of HIV type 1 drug resistance mutations: results from the ENVA-2 genotyping proficiency program. AIDS Res Hum Retroviruses. 2002;18(4):243–8.
9. Korn K, Reil H, Walter H, Schmidt B. Quality control trial for human immunodeficiency virus type 1 drug resistance testing using clinical samples reveals problems with detecting minority species and interpretation of test results. J Clin Microbiol. 2003;41(8):3559-65.
10. Brumme CJ, Poon AFY. Promises and pitfalls of Illumina sequencing for HIV resistance genotyping. Virus Res. 2017 ;239:97–105.
11. Scutari R, Colagrossi L, Bezenchek A, et al. The application of HIV-1 genotype resistance test: a multicentre Italian virology laboratory experience. ICAR 2023, Poster 331.
12. Ávila-Ríos S, Parkin N, Swanstrom R, et al. Next-Generation Sequencing for HIV Drug Resistance Testing: Laboratory, Clinical, and Implementation Considerations. Viruses. 2020;12(6).
13. Armenia D, Spagnuolo V, Bellocchi MC, et al.on behalf of the PRESTIGIO Registry. Does NGS on HIV-1 DNA improve resistance assessment in highly treatment-experienced and multi-resistant individuals under virological control? An experience from the PRESTIGIO Registry. ICAR 2023, Oral communication 127.
14. Curanovic D, Martens SK, Rodriguez MA, et al. HIV-1 DNA Testing in Viremic Patients Identifies More Drug Resistance Than HIV-1 RNA Testing. Open Forum Infect Dis. 2023; 10(4): ofad 146
15. Cutrell AG, Schapiro JM, Perno CF, Kuritzkes DR, Quercia R, Patel P, et al. Exploring predictors of HIV-1 virologic failure to long-acting cabotegravir and rilpivirine: a multivariable analysis. AIDS. 2021;35(9):1333–42.
16. Lübke N, Di Cristanziano V, Sierra S, et al. Proviral DNA as a Target for HIV-1 Resistance Analysis. Intervirology. 2015;58(3):184-9.